I. Quy trình phân tích genome vi khuẩn cơ bản
Quy trình khảo sát genome vi khuẩn thông thường chia làm 2 công đoạn: Trong phòng thí nghiệm (wed-lab) và phân tích dữ liệu trên máy tính (dry-lab). Về cơ bản, quy trình khảo sát trình tự toàn bộ gen vi khuẩn gồm các bước như hình 1. Chúng ta sẽ lần lượt đi vào từng phần của quy trình này trong các bài học cụ thể. Trong bài này chúng ta sẽ khái quát về quy trình trong phòng thí nghiệm, bao gồm: tách chiết DNA, chuẩn bị thư viện DNA cho giải trình tự và giải trình tự toàn bộ gen vi khuẩn.
Hình 1. Sơ đồ quy trình phân tích genome vi khuẩn cơ bản (nguồn: khoá học advance bioinformatic do viện Sanger đào tạo)
II. Ly trích DNA từ vi khuẩn (DNA extraction)
Trong phần này chúng ta sẽ không đi chi tiết về quá trình tách chiết DNA trong phòng thí nghiệm mà chỉ khát quát về phương pháp.
Kỹ thuật tách chiết DNA vi khuẩn là quá trình tinh lọc DNA từ các vi khuẩn để phân tích cấu trúc và chức năng của các gene. Kỹ thuật này có ý nghĩa quan trọng trong nền sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Để tách chiết DNA vi khuẩn, có thể sử dụng các phương pháp truyền thống hoặc các bộ kit thương mại.
Phương pháp truyền thống gồm các bước cơ bản sau:
- Nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn trong môi trường thích hợp.
- Phá màng tế bào vi khuẩn bằng cách nghiền mô và xử lý với dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase K. Từ đó, DNA được giải phóng ra môi trường, đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA.
- Loại bỏ protein bằng cách trộn lẫn DNA với hỗn hợp phenol-chloroform, làm biến tính protein. Sau đó, ly tâm để tách DNA ra khỏi protein. DNA sẽ nằm lại trong pha nước ở phía trên, còn protein sẽ nằm lơ lửng giữa nước và phenol hoặc lắng xuống dưới cùng.
- Tủa và thu DNA bằng cách thêm ethanol hoặc isopropanol vào dung dịch chứa DNA. Sau đó, ly tâm để thu cặn DNA, rửa lại với ethanol 70% để làm sạch mẫu. Cuối cùng, cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cặn DNA trong đệm.
Phương pháp sử dụng bộ kit thương mại gồm các bước cơ bản sau:
- Nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn trong môi trường thích hợp.
- Phá màng tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch ly giải chứa chất tẩy và proteinase K. Từ đó, DNA được giải phóng ra môi trường, đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA.
- Loại bỏ protein và các thành phần khác của tế bào vi khuẩn bằng cách rửa lại mẫu với dung dịch rửa chứa ethanol. Sau đó, ly tâm để loại bỏ các chất tạp nhiễm.
- Thu DNA bằng cách cho qua màng lọc có khả năng gắn kết DNA. Sau đó, rửa lại màng lọc với dung dịch rửa chứa ethanol để loại bỏ các chất tạp nhiễm khác. Cuối cùng, elute DNA từ màng lọc bằng dung dịch elute chứa nước hoặc đệm.
Sau khi tách chiết được DNA vi khuẩn, có thể tiến hành giải trình tự toàn bộ gene của chúng bằng các phương pháp như PCR, Sanger sequencing hoặc next-generation sequencing
III. Chuẩn bị thư viện DNA cho quá trình giải trình tự (DNA preparation)
Quá trình chuẩn bị thư viện cho DNA vi khuẩn trong giải trình tự toàn bộ gene là một bước quan trọng để có thể đọc được trình tự các nucleotide trong DNA. Có nhiều phương pháp khác nhau để chuẩn bị thư viện DNA, nhưng một trong những phương pháp phổ biến là shotgun sequencing. Trong nội dung của bài học cơ bản này chúng tôi sẽ đi vào chi tiết với kỹ thuật này.
Phương pháp này bao gồm các bước sau:
- Tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu.
- Phân đoạn DNA vi khuẩn thành các đoạn ngắn ngẫu nhiên bằng cách sử dụng các enzyme cắt hoặc phương pháp vật lý.
- Thêm các đầu nối (adapters) vào hai đầu của mỗi đoạn DNA để có thể gắn chúng vào nền tảng giải trình tự.
- Lựa chọn và tinh sạch các đoạn DNA có kích thước mong muốn (thường là từ 200 đến 600 nucleotide).
- Khuếch đại các đoạn DNA bằng PCR để tăng số lượng và đồng đều hóa thư viện.
- Kiểm tra chất lượng và lượng của thư viện DNA bằng các phương pháp như gel electrophoresis, qPCR, hay bioanalyzer.
Sau khi có được thư viện DNA, ta có thể tiến hành giải trình tự toàn bộ gen của vi khuẩn bằng các thiết bị như Illumina, PacBio, hay Oxford Nanopore
IV. Thực hiện giải trình tự toàn bộ gen vi khuẩn
Sau khi có thư viện DNA, bạn có thể tiến hành trình tự hóa bằng hai phương pháp khác nhau: Miseq sequencing và Oxford nanopore sequencing.
- Miseq sequencing: Bạn cần sử dụng máy trình tự hóa Illumina MiSeq và các kit phản ứng tương thích. Bạn cần chuẩn bị các dung dịch phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất và đổ vào các vị trí tương ứng trên cartridge. Bạn cũng cần chuẩn bị flow cell và đặt vào máy. Bạn cần chọn chế độ trình tự hóa phù hợp với độ dài đọc trình tự mong muốn (ví dụ: 2×300 bp) và khởi động máy. Quá trình trình tự hóa sẽ diễn ra trong khoảng 24-48 giờ tùy thuộc vào chế độ bạn chọn. Sau khi hoàn thành, bạn có thể lấy flow cell ra và lưu trữ hoặc xử lý theo quy định. Bạn có thể tải xuống dữ liệu trình tự hóa từ máy về máy tính để phân tích.
- Oxford nanopore sequencing: Bạn cần sử dụng máy trình tự hóa Oxford Nanopore MinION và các kit phản ứng tương thích. Bạn cần chuẩn bị các dung dịch phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất và đổ vào các ống nghiệm. Bạn cũng cần chuẩn bị flow cell và kết nối với máy tính qua cổng USB. Bạn cần chạy phần mềm MinKNOW để kiểm tra chất lượng flow cell và khởi động quá trình trình tự hóa. Bạn cần thêm một lượng nhỏ thư viện DNA vào flow cell và theo dõi quá trình trình tự hóa trên màn hình máy tính. Quá trình trình tự hóa có thể kéo dài từ vài giờ đến vài ngày tùy thuộc vào lượng DNA bạn thêm vào. Sau khi hoàn thành, bạn có thể lấy flow cell ra và lưu trữ hoặc xử lý theo quy định. Bạn có thể tải xuống dữ liệu trình tự hóa từ máy tính để phân tích.
Tới đây chúng ta đã khái quát các bước thực hiện trong phòng thí nghiệm. Trong bài tiếp theo chúng ta sẽ đi vào các kỹ thuật phân tích trên máy tính
1,191 total views, 4 views today